氨基bi林-N-脫甲基酶（AND）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND 作為P450酶系的重要一員，相當(dāng)于CYP3A4 亞型，與藥物的去甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。

測定原理：

AND 催化氨基bi林釋放甲醛，通過 Nash 比色法測定甲醛含量，即可計算出 AND 活性。

氨基bi林-N-脫甲基酶活性測定試劑盒   P450

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100ml 蒸餾水充分溶解。

試劑三：粉劑×1 管，4℃避光保存。臨用前加入 1ml 無水乙醇，充分溶解。試劑四：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入 0.5ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1 瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水 4ml 充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，-20℃保存。臨用前取 1.5ml EP 管，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，加 990μl 蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)jia醛溶液，4℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

普通離心機，超速離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1 ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心 30min，取上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需

當(dāng)天使用。

AND 活性測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3. 對照管：取 1 支EP 管，加入 10μl 粗酶液，170μl 試劑二，10μl 試劑三，10μl 蒸餾水，混勻后置于 37℃

水浴保溫 30min；立即加入 35μl 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μl 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取新的EP 管，加入 100μl 上清液，100μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測定光吸收，記為A 對照管。

4. 測定管：取 1 支EP 管，加入 10μl 粗酶液，170μl 試劑二，10μl 試劑三，10μl 試劑四，混勻后置于 37℃

水浴保溫 30min；立即加入 35μl 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μl 試劑六，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min；取 1 支新EP 管，加入 100μl 上清液，100μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測定光吸收，記為A 測定管。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 1 支EP 管，加入 100μl 標(biāo)準(zhǔn)品，100μl 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測定光吸收，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個樣品都需要做對照管。

AND 活性計算：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

AND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品× V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

（2） 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

AND 活性(nmol/min/g 鮮重 ) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V 樣

÷V 樣總×W)÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W。

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V 樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；V 樣總：提取液體積，0.5ml；T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

AND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管× 稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷ A 標(biāo)準(zhǔn)管÷ Cpr。

（2） 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個酶活單位。

AND 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(V 樣÷V樣總×W)÷T

= 45×（A 測定管－A 對照管）÷ A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W。

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V 樣：加入粗酶液體積，50μl=0.05ml；V 樣總：提取液體積，0.5 ml；T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

注意事項：

1、粗酶液需在當(dāng)日完成測定，如需保存，則向粗酶液提取步驟 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油，分裝后，

-80℃保存；

2、試劑三和試劑四需臨用前配制，如當(dāng)天沒有用完，4℃避光保存，可用 1 周；

3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定，建議用 BCA 法測蛋白含量。

氨基bi林-N-脫甲基酶活性測定試劑盒   P450