苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

細胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH 在P450 酶系中相當(dāng)于CYP2E1 亞型，CYP2E1 不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。

測定原理：

AH 催化苯胺羥化后產(chǎn)生的 4-氨基酚，進一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?/span>-吲哚復(fù)合物，在 630nm 處有特征吸收峰；通過測定 630nm 吸光度增加速率，來計算AH 活性。

苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 100ml 蒸餾水，充分溶解。試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分溶解。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5ml 蒸餾水，充分溶解。

試劑六：粉劑×1 瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水，充分溶解。試劑七：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10ml 蒸餾水充分溶解。

標(biāo)準液：液體×1 瓶，10μmol/L，4℃避光保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

普通離心機、超速離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、雙蒸水和冰。

粗酶液提取：

1、除去細胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織，加入 1ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄

上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 630 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3. 試劑五置于冰浴預(yù)冷 30min。

4. 標(biāo)準管：取 0.5 ml EP 管，加入 100μl 標(biāo)準液，100μl 試劑六，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收，記為A 標(biāo)準管。

5. 對照管：取 0.5 ml EP 管，加入 50μl 粗酶液，100μl 試劑三，50μl 蒸餾水，混勻后 37℃水浴中保溫 30min；

再加入 100μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃，離心 10min；取 100μl 上清液，加入新的 0.5 ml EP 管；再加入 100μl 試劑六，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收，記為 A 對照管。

6. 測定管：取 0.5 ml EP 管，加入 50μl 粗酶液，100μl 試劑三，50μl 試劑四，混勻后 37℃水浴中保溫 30min；

再加入 100μl 試劑五，混勻后冰浴 5min，11000rpm，4℃，離心 10min；取 100μl 上清液，加入新的 0.5 ml EP 管；再加入 100μl 試劑六，100μl 試劑七，混勻后室溫靜置 30min，吸取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，630 nm 測定光吸收，記為 A 測定管。

AH 活性計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管÷Cpr。

（2） 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管÷W

C 標(biāo)準品：10μmol/L；V 標(biāo)準品：100μl=1×10^-4L；稀釋倍數(shù)： V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml； T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 4-氨基酚為 1 個酶活單位。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管×稀釋倍數(shù)÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準管÷W

C 標(biāo)準品：10μmol/L；V 標(biāo)準品：100μl=1×10^-4L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒； W ：樣品質(zhì)量； V 樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml； T：催化反應(yīng)時間（min），30min。

苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒