6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）試劑盒 輔酶

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

G6PDH（EC 1.1.1.49）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化為 6 -磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將 NADP+還原為NADPH，供生物合成及維持細(xì)胞內(nèi)的還原狀態(tài)用。因此 6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的高低可以從一定程度上反映出生物體的生物合成和抗氧化能力。

測(cè)定原理：

G6PDH 催化NADP+還原生成NADPH，在 340 nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 試劑一，混勻后立即記錄 340nm 處 1min 后吸光值A1 和 6min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：若ΔA 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋?zhuān)?jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。或?qū)⒎磻?yīng)時(shí)間縮短至 2min，使A2-A1 小于 0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。

G6PDH 活力單位的計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）G6PDH 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=643×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.3215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬(wàn)。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）G6PDH 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1286×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷ (V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.643×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000 萬(wàn)。

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