諾博萊德 Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒Caspase-4 Activity Assay Kit

Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

產(chǎn)品貨號(hào)：BC1628

產(chǎn)品名稱：Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒Caspase-4 Activity Assay Kit

英文名稱：Caspase-4 Activity Assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T/20T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

檢測(cè)方法：比色法 Colorimetric

儲(chǔ)存條件：Store at -20℃，6 months

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderBC1628 Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒Caspase-4 Activity Assay Kit是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的蛋白酶家族，包含10多個(gè)成員。Caspase-4可以和 Apaf-1相互作用，并參與細(xì)胞se素c導(dǎo)致的Caspase-3激活，也可以和 caspase-14 相互作用。試劑盒測(cè)定原理基于Caspase-4特異水解其多肽底物 AC-LEVD-pNA,釋放出游離的硝基苯胺 pNA，后者呈黃色在 405nm 具有最大吸收峰，采用可見(jiàn)光光度比色法測(cè)定。適用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞 Caspase-1活性。

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、100uL 玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟:

一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn))

1、培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)胞到離心管，離心后棄上清;按照細(xì)胞數(shù)量(約106個(gè))加100L試劑二(若裂解不充1.分可提高至 150-200μL)，震蕩重懸沉淀，置冰上靜置15 min，15000g4℃離心 10-15min，取上清置冰上待測(cè)。

2、組織按照組織質(zhì)量(g):試劑二體積(mL)為1:5-10的比例(建議稱取約01g組織，加入1mL 試劑二)冰浴研磨或充分剪碎，置冰上靜置15min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋:將5mmolL pNA 標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋至 200、100、50、25、12.5、0umolL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

注意事項(xiàng):

1、由于試劑二中含有還原劑(DTT)，建議將樣本用水稀釋2倍后，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，以降低 DTT對(duì)蛋白濃度測(cè)定的干擾。不建議使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

2、Caspase 活性測(cè)定值低最常見(jiàn)的原因是細(xì)胞未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少，其次是觀測(cè)時(shí)間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí)，2并非劑量越大時(shí)間越長(zhǎng) Caspase 活性就越高。建議設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí)，以檢測(cè)最佳的觀察點(diǎn)。

3、所測(cè)樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上x(chóng)ian時(shí)，可用試劑二稀釋樣本后重新測(cè)定。

4、蓋緊 96孔板蓋子并用封口膜密封。37℃孵育，肉眼可見(jiàn)顏色變黃時(shí)的 OD405值約為0.2，此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過(guò)夜，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。

Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

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