乙酰fu酶A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

ACC在生物體內(nèi)催化乙酰fu酶A羧化生成丙二酰fu酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

測定原理：

ACC 能夠催化乙酰fu酶A、NaHCO3 和ATP 生成丙二酰fu酶A、ATP 和無機磷，通過鉬酸銨定磷法測定無機磷的增加量來測定 ACC 活性。

組成：

試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。試劑七：10μmol/ml 標準磷貯備液 10ml×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)試劑的配制和預熱：在試劑二瓶中加入 2.5ml 試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入 2ml蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 10 分鐘。

3、定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/ml 標準磷應(yīng)用液配制：將試劑七 20 倍稀釋，即取 0.5ml 試劑七加 9.5 蒸餾水，充分混勻。

5、酶促反應(yīng)

37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準確反應(yīng) 30min 后，90℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心 5min，取上清

6、定磷

混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）保溫 30min，冷卻至室溫，在 660nm 處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值A。標準管、空白管只要做一次即可，每個測定管需要設(shè)一個對照管。

注意：若測定管吸光值大于 2，將樣品用提取液稀釋適當倍數(shù)后再進行測定，使吸光值小于 2，可提高檢測靈敏度，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

ACC 活性計算：

1、按組織蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷ (V 樣×Cpr)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

定義：每小時每g 組織產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。

ACC (μmol/h /g 鮮重)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管）×V 總÷ (W× V 樣÷V 樣總)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W

3、按細菌或細胞密度計算：

定義：每小時每 500 萬細菌或細胞產(chǎn)生 1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。

ACC (U/10⁴ cell)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管）×V 總÷ (500× V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

C 標準管：標準管濃度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.1ml；V 樣：加入樣本體積，0.01ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，0.5 小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g； 500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。