FlashPure sgRNASynthesis Kit

高效 sgRNA 體wai轉(zhuǎn)錄試劑盒

高效sgRNA體wai轉(zhuǎn)錄試劑盒 T7體wai轉(zhuǎn)錄

目錄號(hào):91615

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件： -20℃保存，有效期 12 個(gè)月。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)是現(xiàn)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和育種研究等領(lǐng)域的常用手段。該技術(shù)體系僅需要Cas9蛋白和sgRNA即可實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯，其中Cas9蛋白是通用組分（無(wú)需修改），sgRNA則需要根據(jù)不同靶位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)錄。

高效sgRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒采用T7 RNA聚合酶復(fù)合物高效轉(zhuǎn)錄spCas9sgRNA。試劑盒中的反應(yīng)體系根據(jù)sgRNA特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)反應(yīng)可在4小時(shí)內(nèi)（實(shí)際操作為半天或1天之內(nèi)）獲得多達(dá)100~200μg的sgRNA。sgRNA可直接用Cas9蛋白體外切割，純化后可用于細(xì)胞注射等實(shí)驗(yàn)。

試劑盒中配備了合成sgRNA轉(zhuǎn)錄模板，sgRNA轉(zhuǎn)錄所需的全部試劑，用戶僅需要合成含有1條CRISPR靶點(diǎn)的引物就能完成sgRNA體外轉(zhuǎn)錄。

操作步驟：

1. 設(shè)計(jì)PCR正向引物，替換標(biāo)紅的N(20)即可：

Primer Target：5’TAATACGACTCACTATAGGN(20)GTTTTAGAGCTAGAAATA -3’

注：spCas9識(shí)別的靶點(diǎn)為20nt，共20個(gè)堿基序列，N(20)為靶位點(diǎn)不包含PAM的20個(gè)堿基序列，建議避免選擇有3個(gè)（或3個(gè)以上）連續(xù)T堿基的位點(diǎn)。

2. 找公司合成Primer Target，稀釋到 1mM 濃度備用。

3. 配制PCR反應(yīng)體系：

4. 制備體外轉(zhuǎn)錄模板，設(shè)置反應(yīng)程序如下：

5. 按下表配制sgRNA轉(zhuǎn)錄體系，37℃反應(yīng)4 hours。（操作過(guò)程中采用無(wú)RNA酶耗材）

6. (可選步驟) 在反應(yīng)體系中加入1 μL的DNase I ，37℃孵育 15 min，消化轉(zhuǎn)錄的DNA模板。

7. 過(guò)柱純化：

提示：第一次使用前請(qǐng)先在 Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽，并做好標(biāo)記。sgRNA 容易降解，全程使用無(wú)酶耗材，請(qǐng)小心操作、避免降解。

（1）于冰上，用 RNase-Free H2O 將 RNA 樣品補(bǔ)足至 100 μL， 加入 200 μL Buffer MRC，輕柔混勻。

（2）加入 375 μL（1.25 倍體積）無(wú)水乙醇并混勻。

（3）將上一步所得溶液加入一套吸附柱中，13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液，將吸附柱重新套回收集管。

（4）加入 700 μl Wash Solution 1（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙 醇），13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（5）漂洗：加入 500 μl Wash Solution 2/3，13,000 rpm 離心 30 sec，棄濾液。

（6）二次漂洗：重復(fù)步驟（5）一次。

（7）干燥：將離心吸附柱于 13,000 rpm 離心 2 min，甩干殘留的漂洗液。

（8）洗脫：將吸附柱放入一個(gè)新的 1.5 ml 離心管中，在吸附膜的中央懸空滴加 10 ~ 40 μl RNase-Free H2O，室溫放置 2 min，13,000 rpm 離心 1 min，收集 sgRNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

高效sgRNA體wai轉(zhuǎn)錄試劑盒 T7體wai轉(zhuǎn)錄