HiPure Yeast Plasmid Mini Kit

酵母高純度質(zhì)粒大量快速提試劑he

酵母高純度質(zhì)粒大提試劑he 核酸提取

目錄號(hào)：31119-10

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下，可保存 12 個(gè)月。加入 RNase A 后的溶液 P1 應(yīng)置于 2 ~ 8℃

保存，可穩(wěn)定保存 6 個(gè)月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新補(bǔ)加即可。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒用于高純度酵母質(zhì)粒 DNA 的小量制備。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質(zhì)?？蓮木w中釋放出來(lái)，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過(guò)清洗液的洗滌可去除雜質(zhì)，在低鹽、高 pH 條件下洗脫，最后得到純度較高的質(zhì)粒 DNA。所得質(zhì)?？芍苯佑糜趍ei切、轉(zhuǎn)化、PCR、RT-qPCR、測(cè)序及轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)：

1.通常酵母的拷貝數(shù)都很低，高拷貝最大得率一般為每 5 ml 培養(yǎng)物提取 1 μg 左右的質(zhì)粒。用于下游試驗(yàn)時(shí)通常建議使用量為：1-5 μl 用做 PCR 模板;5-10 μl 用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選擇高效率的感受態(tài)細(xì)胞。

2.    用戶需要自備 Sorbitol buffer( 1M 山梨chun， 0.1M  Na2EDTA，14 mM β-巰基乙chun)。 配制方法：在 600 ml 去離子水里面溶解 182.2 克山梨chun，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié) PH 值，定容到 1L，4℃保存。臨用前加 0.1%β-巰基乙chun(商品化的 β-巰基乙chun摩爾濃度一般為 14M)。

3.         使用前請(qǐng)先檢查平衡液、溶液 YP2 和溶液 YP3 是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

4.     溶液YP1，YP2 和YP3 的用量比例，若細(xì)菌量增大，需按比例放大這些溶液的使用量；

重要提示：

一、第一次使用前請(qǐng)先在去蛋白液 PD、漂洗液 WB 中加入zhi定量無(wú)水乙chun（見(jiàn)瓶身標(biāo)簽），充分混勻，并做好標(biāo)記，以免多次加入。

二、首ci使用時(shí)請(qǐng)先將 RNase A 全部加到溶液YP1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巰基乙chun，回復(fù)到室溫備用。

操作步驟：

1.   取 100 - 180 ml 酵母培養(yǎng)物，12,000 x g 離心 1 min，盡可能的吸棄上清，收集菌體。

（注意： 如果用 50ml 離心管收集菌體，可以離心棄上清后，在同一管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟

1，直到收集到足夠多的菌體）

2. 加入 10 ml Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞；加入 0.1 g Lyticase (Lyticase 臨用前用 2ml Sorbitol buffer 溶解)，充分顛倒混勻，37℃溫育 1 – 2 小時(shí)消化細(xì)胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。

（注意：如果破壁效果不好導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)量低，可以加大 lyicase 用量來(lái)提高mei工作濃度，還可以延長(zhǎng)消化時(shí)間來(lái)提高效果，不適合 Lyticase 消化的酵母可選用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠渦旋，反復(fù)凍融等。）

3.       12,000 x g 離心 2 min，盡可能吸棄上清，加入 7 ml 溶液YP1，重懸菌體沉淀，渦旋震

蕩至che底懸浮。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

4.  加入 7 ml 溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時(shí)間不要超過(guò) 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞，如未wan全變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 YP3 的用量也要相應(yīng)增加）

5.  加入 10 ml 溶液YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，

然后室溫 12,000 x g 離心 10 -15 min, 小心取上清，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 YP3 后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀,如果上清中還有白色漂浮物，可再次離心取上清）

6.        將上清液加入吸附柱中（吸附柱最大容量 10ml），室溫 12,000 rpm 離心 1 min，質(zhì)粒被

吸附在膜上，棄濾液。重復(fù)步驟直到上清全部被加入吸附柱。

7.        可選步驟：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PD，室溫 12,000 x g 離心 1 min，棄濾液。

8.  加入 10 ml 漂洗液 WB，室溫 12,000 x g 離心 1 min，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無(wú)水乙chun，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

9. 重復(fù)步驟 8 一次。

10.      室溫 12,000 x g 離心 2 min，甩干膜上殘留乙chun。打開(kāi)蓋子室溫晾干 2 – 3 min。

（注意：此步不能省略，否則殘留乙chun會(huì)影響質(zhì)粒的后續(xù)使用）

11.     將吸附柱置于一個(gè)新的 50 ml 離心管（自備）中，加入 0.6 - 1ml 的洗脫緩沖液EB，室溫放置 2 min，12,000 rpm 離心 2 min，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預(yù)熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調(diào)整其 pH值在 7.0 - 8.5 之間。）

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