NAD 激酶（NAD kinase, NADK）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)惟一能夠催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP 或無機(jī)多聚磷酸[poly(P)]作為磷?；w進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理：

NADK 催化NAD+磷酸化，生成 NADP+；NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；在 340 nm下測定NADPH 增加速率?？煞从吵?NADK 活性的大小。

NAD 激酶試劑盒 輔酶Ⅰ系列-常備現(xiàn)貨

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸餾水。

樣本測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一和試劑二 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 15min 以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入 5ml 試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入 18ml 試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 15min，立即煮沸 2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，25℃離心 10min，取上清

加完試劑混勻，室溫靜置 15min，340nm 下測定吸光值，ΔA=A 測定-A 對照。

NADK 活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADK 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=53.59×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADK 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.107×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADK 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 ml 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol 的NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=107.18×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADK 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=107.18×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADP 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.214×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。