諾博萊德 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取試劑盒

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取試劑盒 常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號：P4998

產(chǎn)品名稱：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡介：

中文名稱：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取試劑盒

規(guī)格：100T ; 50T

儲存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder P4998 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取試劑盒

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于除哺乳動物成熟的紅細(xì)胞外的各種真核細(xì)胞中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為由生物膜構(gòu)成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統(tǒng)，膜片間的隙狀空間稱為池，通常與細(xì)胞外隙和細(xì)胞漿基質(zhì)之間不直接相通。這種細(xì)胞內(nèi)的膜性管道系統(tǒng)一方面構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐?，另方面為?xì)胞內(nèi)各種各樣的酶反應(yīng)提供廣闊的反應(yīng)面積。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能與蛋白質(zhì)的合成、糖類和脂類的合成、解毒、同化作用有關(guān)，并且還具有運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取試劑盒可用于各種動物細(xì)胞和實(shí)體軟、硬組織樣本的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白的提取。本試劑盒提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gelshift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

適用樣本：動物細(xì)胞/組織

注：

1. 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。

2. 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

3. 試劑拆封后請盡快使用完！

產(chǎn)品簡介：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于除哺乳動物成熟的紅細(xì)胞外的各種真核細(xì)胞中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為由生物膜構(gòu)成的互相通連的片層隙狀或小管狀系統(tǒng)，膜片間的隙狀空間稱為池，通常與細(xì)胞外隙和細(xì)胞漿基質(zhì)之間不直接相通。這種細(xì)胞內(nèi)的膜性管道系統(tǒng)一方面構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐?，另一方面為?xì)胞內(nèi)各種各樣的酶反應(yīng)提供廣闊的反應(yīng)面積。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能與蛋白質(zhì)的合成、糖類和脂類的合成、解毒、同化作用有關(guān)，并且還具有運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的功能。

本試劑盒可用于各種動物細(xì)胞和實(shí)體軟、硬組織樣本的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的提取。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取的蛋白樣本含有高濃度的鹽成分，不可直接用于2D電泳，需要除鹽后再用于 2D電泳。如下游實(shí)驗(yàn)需要直接用于等電聚焦、雙向電泳，請使用其他貨號的蛋白提取試劑盒。也可以將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，用脫鹽柱脫鹽處理。

自備試劑和儀器：

離心機(jī)、振蕩器、勻漿器、渦旋混勻器、Dounce勻漿器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、使用方便便，從細(xì)胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

2、提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至 30 分鐘-1 小時。

3、含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

4、紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

5、總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

6、蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含 6 種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

使用方法：

一、使用注意事項：

1. 正式實(shí)驗(yàn)前請選取幾個樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，取得優(yōu)良實(shí)驗(yàn)效果

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。

3. 實(shí)驗(yàn)過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

4. 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

5. 如果試劑盒不能短時間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

6. 最好使用Dounce勻漿器勻漿，如果沒有Dounce勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白回收率會下降。

7. 要求離心力30000g-50000g的離心，最好能達(dá)到45000g左右。最小離心力需要保證30000g。若實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)較小達(dá)不到30000g的離心力，或者離心管質(zhì)量不能承受30000g的離心力，請使用能達(dá)到的最大離心力。此時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)得率會相對較低。

8. 如果需要回收所有光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡的蛋白，50000g離心步驟的離心力需要提高到100000g。

9. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。

10. 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

二、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提取：

1. 提取液制備：

每 200μl 冷的蛋白提取液 C 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每 200μl 冷的蛋白提取液 D 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】:

1)根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

2)加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3)以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取 1-2×10

7個細(xì)胞，在 4℃，500×g 條件下離心 2-3 分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞；

3. 用冷 PBS 洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4. 加入 500μl 冷的試劑 A，置冰上 10 分鐘。

5. 用 Dounce 勻漿器勻漿充分勻漿，然后在 4℃，1000×g 條件下離心 5 分鐘。

6. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

7. 在 4℃，11000×g 條件下離心 10 分鐘，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

8. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

9. 在沉淀中加入 400μl 冷的試劑 B，混勻。

10. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

11. 棄上清，沉淀中加入 100-200μl 冷的蛋白提取液 C，混勻。

【注】:

1)提取液 C 使用前必須保持在 2-8℃條件。

12.在 4℃條件下振蕩 30-40 分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。

【注】:

1)此步驟必須在 2-8℃處理。

2)用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持液體晃動即可。

3)沒有 2-8℃振蕩條件也可以不振蕩，置 2-8℃靜置，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

13. 在 4℃，12000×g 條件下離心 5 分鐘。棄沉淀，收集上清。

14. 將上清吸入另一干凈離心管，在 37℃水浴 10 分鐘。

15. 在 37℃，1000g 力離心 5 分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為 20-30μl。

【注】:

1)此步驟必須在 37℃條件下離心。

2)沒有 37℃離心條件也可以不離心，稍微延長 37℃水浴時間，至液體澄清，分層清晰。

16. 小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。

【注】:

1)上層部分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非膜蛋白的蛋白。

2)待下游目的膜蛋白實(shí)驗(yàn)完成后在丟棄此部分。膜蛋白萃取不wan全時此部分蛋白仍可以進(jìn)行再次提取膜蛋白。

17. 用 50-100μl 冷的試劑 D 膜蛋白溶解液溶解下層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白部分，即得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白。

18. 將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

【注】:

1)建議用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。

2)蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

三、組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白提?。?/span>

1. 提取液制備：

每 200μl 冷的蛋白提取液 C 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每 200μl 冷的蛋白提取液 D 中加入 1μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】:

1)根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

2)加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3)以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2. 取 50-100mg 新鮮動物組織樣本，用 PBS 洗滌干凈；

3. 用剪刀盡可能剪碎，用冷 PBS 洗滌兩次。

4. 加入 500μl 冷的試劑 A，置冰上 10 分鐘。

5. 用 Dounce 勻漿器充分勻漿 30-40 下，至無明顯固體團(tuán)塊。然后在 4℃，1000×g 條件下離心 5 分鐘。

6. 將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

7. 在 4℃，11000×g 條件下離心 10 分鐘，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

8. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

9. 在沉淀中加入 400μl 冷的試劑 B，混勻。

10. 在 4℃，30000×g -50000×g 條件下離心 45 分鐘。

11. 棄上清，沉淀中加入 100-200μl 冷的蛋白提取液 C，混勻。

【注】:

1)提取液 C 使用前必須保持在 2-8℃條件。

12. 在 4℃條件下振蕩 30-40 分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。

【注】

1)此步驟必須在 2-8℃處理。

2)用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持液體晃動即可。

3)沒有 2-8℃振蕩條件也可以不振蕩，置 2-8℃靜置，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

13. 在 4℃，12000×g 條件下離心 5 分鐘。棄沉淀，收集上清。

14. 將上清吸入另一干凈離心管，在 37℃水浴 10 分鐘。

15. 在 37℃，1000g 力離心 5 分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為 20-30μl。

【注】:

1)此步驟必須在 37℃條件下離心。

2)沒有 37℃離心條件也可以不離心，稍微延長 37℃水浴時間，至液體澄清，分層清晰。

16. 小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。

【注】:

1)上層部分為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非膜蛋白的蛋白。

2)待下游目的膜蛋白實(shí)驗(yàn)完成后在丟棄此部分。膜蛋白萃取不wan全時此部分蛋白仍可以進(jìn)行再次提取膜蛋白。

17. 用 50-100μl 冷的試劑 D 膜蛋白溶解液溶解下層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白部分，即得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白。

18. 將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

【注】:

1)建議用 BCA法進(jìn)行蛋白定量。

2)蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

注意事項：

1. 本試劑盒僅供科學(xué)研究使用，不可用于診斷或治療。

2. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

3. 實(shí)驗(yàn)后完成后所有樣品及接觸過的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。

4. 避免皮膚或粘膜與試劑接觸。

5. 如果試劑不小心接觸皮膚或眼睛，應(yīng)立即用水沖洗。

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