諾博萊德  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase

T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase   核酸檢測(cè)

產(chǎn)品貨號(hào)：T9298

產(chǎn)品名稱(chēng)：T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase

英文名稱(chēng)：T4 DNA ligase

產(chǎn)品別名：T4 DNA連接試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：60U

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：Store at -20℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderT9298  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase特性：

高效連接粘性末端和平末端

T/A 克隆

dsDNA 切刻修復(fù)

構(gòu)建高豐度克隆文庫(kù)

RNA 和 DNA 的連接

概述：

該酶催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5′-磷酸末端和 3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻。

來(lái)源：

純化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8。

反應(yīng)條件：

1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液

[50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃），10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP]。推薦 DNA 5′ 末端濃度為 0.1-1.0 μM，16℃ 溫育。

熱失活：65℃ 10 分鐘。

單位定義（粘性末端活性單位）：

1 單位指在 20 μl 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液中，16℃ 反應(yīng)條件下，30 分鐘能使 50% 的經(jīng) HindⅢ 消化的λDNA 片段 [ 5′ 端濃度為 0.12 μM（300 μg/ml）] 連接所需的酶量。

注意事項(xiàng)：

與 E. coli DNA 連接酶需要 NAD+ 作輔因子不同，T4 DNA 連接酶的輔因子是 ATP。

稀釋后的 T4 DNA 連接酶應(yīng)于 -20℃、50% 甘油貯存緩沖液（稀釋緩沖液 A，NEB #B8001）中保存。如稀釋后馬上使用，也可用 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液稀釋。

只要在反應(yīng)體系中補(bǔ)加 1 mM ATP，連接反應(yīng)就可以在 NEB 提供的四種限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液或在T4 DNA 多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。

使用示例：

1、先將 10×T4DNALigaseBuffer 在冰上融化，并進(jìn)行短暫的離心。

2、以 20μL 連接體系示例，在無(wú)菌微量離心管中加入以下各種成分：

【注】：平末端載體與DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防發(fā)生自連接現(xiàn)象。為提高連接效率，每20µL反應(yīng)體系中可以加2µL50%PEG4000。

3、16℃連接過(guò)夜。

4、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

1）將連接產(chǎn)物加入到100µL 感受態(tài)細(xì)胞中（連接產(chǎn)物不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的1/10），輕彈混勻，冰上孵育30min。

2）將離心管于42℃，熱激90sec（不要晃動(dòng)），之后立刻置于冰水浴靜置2-3min。

3）向離心管中加入900µLLB或SOC培養(yǎng)基，37℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)45min，該過(guò)程使菌體復(fù)蘇，抗性基因表達(dá)。

4）2500 g 離心5min，吸去900µL上清，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體，用無(wú)菌涂布棒將剩余菌體在正確抗性的平板上涂布均勻，待菌液被平板吸收后，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

【注】：如果使用超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化效率＞108cfu/µg），可直接吸取100-200µL37℃孵育后的菌液涂板，剩余菌液可在4℃保存，1周內(nèi)均可重新涂板。

注意事項(xiàng)：

1、10×T4DNALigaseBuffer 中含有 ATP，為避免 ATP 的降解，建議解凍后分裝凍存于-20℃。

10×T4 DNA Ligase Buffer 在融解時(shí)，如果出現(xiàn)少量沉淀屬正常現(xiàn)象，請(qǐng)顛倒混勻后使用。

2、平末端的載體與 DNA 片段連接時(shí)，應(yīng)首先對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化，以防止載體自身環(huán)化。

注意：如果向反應(yīng)體系中加入 PEG 可以促進(jìn)平末端的連接，但 PEG 可能導(dǎo)致cDNA 片段克隆產(chǎn)物 出現(xiàn)串聯(lián)體并抑制包裝的反應(yīng)。

3、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4、本產(chǎn)品僅作科研用途！

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