諾博萊德West Femto ECL超敏發(fā)光液,West Femto ECL Substrate

West Femto ECL超敏發(fā)光液 顯色與信號檢測

產(chǎn)品貨號：PE8818

產(chǎn)品名稱：West Femto ECL超敏發(fā)光液,West Femto ECL Substrate

產(chǎn)品規(guī)格：2*12.5ml / 2*50ml

產(chǎn)品簡介：

英文名稱：West Femto ECL Substrate

中文名稱：West Femto ECL超敏發(fā)光液

規(guī)格：2*12.5ml ; 2*50ml

純度：＞99%

儲存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品介紹：

NobleRyder PE8818 West Femto ECL超敏發(fā)光液,West Femto ECL Substrate用于檢測直接或間接標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。由于采用了du特的發(fā)光底物系統(tǒng)，West Femto ECL超敏發(fā)光液是目前zui靈敏的商業(yè)化熒光ECL檢測試劑：
(1) 具有ji高靈敏度和高信噪比，可檢測10～100 fg抗原;
(2) 可在日光燈下進(jìn)行發(fā)光操作;
(3) 發(fā)光迅速，熒光可使X光膠片感光達(dá)12小時(shí)以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測;
(4) 可使用更高的抗體稀釋倍數(shù)(1:2000～1:10000)，極其節(jié)省抗體。
2. 用途：用于HRP標(biāo)記抗體的Western Blot和HRP標(biāo)記探針的核酸雜交。
3. 使用方法:
(1)執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜和Western Blot步驟。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-生wu素-HRP夾法。
(2)Western Blot最后一次洗膜的同時(shí)新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。
(3)用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜wan全干燥。將膜wan全浸入發(fā)光工作液(0.125mL發(fā)光工作液/cm2膜)中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時(shí)間過長不會增加靈敏度，有時(shí)還會導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進(jìn)行，也會導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。
(4)用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
(5)打開X光膠片暗盒，在暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來wan全包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
(6)暗房內(nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時(shí)間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。
4. 儲存：4  ℃密封避光保存一年以上。短期可放置室溫。
5. 安全性：無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理。
6. 注意事項(xiàng)：
(1)步驟1～5可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
(2)長時(shí)間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
(3)發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。
(4)由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗。
(5)某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。
(6)使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

(7)NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。

 備注：產(chǎn)品信息可能會有優(yōu)化升級。請以實(shí)際標(biāo)簽信息為準(zhǔn)。    

操作概述：

注：優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽性結(jié)果。有關(guān)建議的稀釋度范圍請參考其他所需材料。

1) 將一抗?jié)舛认♂尩?1ng 至 0.2 μg/mL（以 1 μg/mL 儲存液稀釋 1:5,000 至 1:100,000 倍）

2) 將二抗?jié)舛认♂尩?2ng 至 10 ng/mL（以 1 μg/mL 儲存液稀釋 1:100,000 至 1:500,000 倍）

3) 將兩種底物組份按 1:1 比例混合，制備底物工作液。注：暴漏于日光或任何其他強(qiáng)光可能損害工作液，為獲得最佳結(jié)果，將此工作液保存在琥珀色瓶中， 并避免長期暴漏于任何強(qiáng)光。短時(shí)間暴漏于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)照明不會損害該工作液。

4) 將印跡膜在 West Femto ECL 底物工作液中孵育 5 分鐘。

5) 吸出多余試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。

6) 使印跡膜在 X 光膠片上曝光

蛋白印跡法詳細(xì)操作步驟

1) 將印記膜從蛋白轉(zhuǎn)印設(shè)備中取出，加入合適的封閉液在溫室下孵育 20-60 分鐘，同時(shí)振蕩。以 封閉膜上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。 請注意：使用在前文建議的抗體稀釋度是非常重要的。

2) 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育 1 小時(shí)，同時(shí)振蕩；或在 28℃孵育過夜，不振蕩。

3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜wan全覆蓋。振蕩孵育≥5 分鐘，更換洗滌緩沖液 并重復(fù)該步驟 4-6 次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間有助于降低背景信號。

注：孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。 請注意：使用在前文建議的 HRP 標(biāo)記二抗稀釋度是非常重要的。

4) 將 HRP 標(biāo)記的二抗工作液與膜在溫室孵育 1 小時(shí)，同時(shí)振蕩。

5) 重復(fù)步驟 3，以除去未結(jié)合的 HRP 標(biāo)記二抗。

注：膜與 HRP 標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行che底洗滌。

6) 將 A 溶液與 B 液等比例混合，制備成工作液。每 cm2膜使用 0.01～0.1ml 工作液。工作液可以 在溫室下穩(wěn)定 8 小時(shí)。

注：暴漏雨日光或任何其他強(qiáng)光下可能損害工作液，為獲得嘴角結(jié)果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期暴漏雨任何強(qiáng)光。實(shí)驗(yàn)室的常見照明不會損害工作液。

7) 將印記膜在工作液中孵育 5 分鐘。

8) 從工作液中取出印記膜，并置于一個(gè)塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

9) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質(zhì)面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關(guān)閉所有的燈。注意：膠片必須在曝光期間保持干燥，為獲得最佳效果，采取以下措施：

* 確保將多余的底物從膜和塑料紙上wan全去除。

* 在整個(gè)膠片處理期間，使用手套。

* 切莫將印記膜置于已顯影的膠片上，因?yàn)槟z片上的化學(xué)物質(zhì)會減弱信號。

10) 將 X 光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光 60 秒。之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到最佳結(jié)果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前 5-30 分鐘期間是zui強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會隨時(shí)間下降，如有底物孵育后較長時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長以獲得較強(qiáng)信號。如果使用 磷光存儲成像設(shè)備（如 Bio-Rad 的分子成像儀系統(tǒng)）或 CCD 照相機(jī)可能需要較長的曝光時(shí)間。

注意：膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。

11) 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進(jìn)行顯影。如果信號太強(qiáng)，則縮短曝光時(shí)間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

West Femto ECL超敏發(fā)光液 顯色與信號檢測

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