Wilson Wolf G-Rex底透氣型細(xì)胞培養(yǎng)瓶

——快速生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞

Wilson Wolf G-Rex底透氣型細(xì)胞培養(yǎng)瓶是美國(guó)Wilson Wolf Manufacturing 為T細(xì)胞免疫療法研發(fā)的一款用于T細(xì)胞培養(yǎng)的裝置，克服了目前T細(xì)胞免疫治療基礎(chǔ)研究中大規(guī)模培養(yǎng)的障礙。G-REX培養(yǎng)瓶通過(guò)底透氣膜使O2和CO2得到充分交換，一次性加入大量培養(yǎng)基可支持細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)時(shí)間不換液，減少換液頻率，減少操作，并且細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不需要搖晃，在普通的CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)即可。目前已被證實(shí)在培養(yǎng)： CTL，TIL ，NK， Vg9Vd2 T cells ，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，病毒特異性T細(xì)胞。

目前，T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)基因是細(xì)胞治療基礎(chǔ)研究的障礙之一。普遍的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟是將激活的T細(xì)胞在涂有RetroNectin的袋子或板上進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在這個(gè)過(guò)程中其中要先預(yù)處理涂有RetroNectin的袋子或板子，然后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后還要更換新的培養(yǎng)容器。這種方法雖然轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對(duì)比較好，但步驟繁瑣，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，而且不符合封閉操作。

G-REX培養(yǎng)瓶不能包被RetroNectin，所以導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)無(wú)法在G-REX瓶子中完成。

Vectofusin-1 (MiltenyiBiotec Inc., Auburn, CA, USA)是一種合成肽，當(dāng)加入到病毒和細(xì)胞的溶液中時(shí)，可以增強(qiáng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。Vectofusin-1形成a-螺旋狀納米纖維，與病毒顆粒結(jié)合增強(qiáng)病毒-細(xì)胞相互作用。

在這里，我們分享一種簡(jiǎn)單的方法，用于在懸浮液中轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，并且作者展示了新的轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟，集成到一個(gè)流線型的制造過(guò)程，而整個(gè)過(guò)程僅僅依賴于一個(gè)單一的G-Rex生物反應(yīng)器。（Christine Gagliardi, Mariam Khall & Aaron E Foster, Streamlined production of genetically modified T cells with activation, transduction and expansion in closed-system G-Rex bioreactors,Cytotherapy,2019;21:1246-1257） 

首先，作者對(duì)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒培養(yǎng)模式和G-REX培養(yǎng)模式做了流程的對(duì)比

 
基于培養(yǎng)袋和G-REX的流程

可以看出，用G-REX和Vectofusin-1，可以簡(jiǎn)化步驟，使得使細(xì)胞激活，轉(zhuǎn)導(dǎo)，擴(kuò)增，收獲都在同一個(gè)G-REX瓶子中完成。
G-REX培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟如下：
在封閉系統(tǒng)G-REX100M-CS中
Day 0 ：PBMC在40ML培養(yǎng)基中復(fù)蘇，激活
Day 2：轉(zhuǎn)導(dǎo)，將Vectofusin-1和病毒液加到G-REX100M-CS中
Day 3：培養(yǎng)基加到最大體積（1L）
之后每天取上清液，檢測(cè)葡萄糖濃度和乳酸鹽濃度。每三天添加一次細(xì)胞因子。
Day11：收獲細(xì)胞（GatheRex）
作者對(duì)兩種培養(yǎng)模式下的細(xì)胞數(shù)目做了對(duì)比，可以看到細(xì)胞數(shù)在第14天左右達(dá)到最大，而且在相同接種數(shù)下，培養(yǎng)袋和G-REX培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目幾乎沒(méi)有差別。
細(xì)胞數(shù)對(duì)比：

擴(kuò)增倍數(shù)對(duì)比： 

 
培養(yǎng)同樣天數(shù)的情況下，需要操作的時(shí)間對(duì)比。
時(shí)間對(duì)比：

 
可以明顯看出G-REX培養(yǎng)在操作的時(shí)間上比傳統(tǒng)操作節(jié)省75%的時(shí)間。

同時(shí)，也對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程所用到的實(shí)驗(yàn)耗材做了價(jià)格上的對(duì)比，可以看出用G-REX培養(yǎng)節(jié)省了38%的費(fèi)用。
價(jià)格對(duì)比：

當(dāng)然，作者還對(duì)兩種培養(yǎng)方式下，收獲的T細(xì)胞的表型和功能進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表面并無(wú)差異，詳情見(jiàn)文章。
本篇文章介紹了在G-REX瓶子中完成T細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)、擴(kuò)增、收獲等步驟，雖然轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式略低，但在操作時(shí)間，費(fèi)用等方面節(jié)省很多，而且消除了細(xì)胞在激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的清洗和轉(zhuǎn)移，降低了操作步驟，減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)。而且也附和我國(guó)頒布的《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中，提出的細(xì)胞治療基礎(chǔ)研究者應(yīng)不斷優(yōu)化制備工藝，減少物理、化學(xué)或生物學(xué)作用對(duì)細(xì)胞的特性產(chǎn)生非預(yù)期的影響，盡量達(dá)到自動(dòng)化、全封閉的生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。